Dirigent i specialist za glazbu 20. stoljeća, Stefano Mazzoleni je, osim dirigiranja, studirao glasovir, kontrabas, zborsku glazbu, zborsko dirigiranje i eksperimentalnu kompoziciju na Glazbenoj akademiji u Fiesoleu, u klasi Sylvana Bussottija, te orkestralno dirigiranje u Beču.

Ravnao je brojnim orkestrima na simfonijskim koncertima i u operama, te surađivao s uglednim solistima u Europi, Japanu, Kini, Sjedinjenim Državama te Centralnoj i Južnoj Americi: Orchestra di Padova e del Veneto, Orchestra Filarmonia Veneta, Orchestra Città di Ferrara, FVG Mitteleuropa Orchestra, Orchestra Sinfonica della Provincia di Bari, Simfonijski orkestar Sappora u Japanu, Pekinški simfonijski orkestar u Kini, Nova filharmonija Hong Konga, Simfonijski orkestar Taipeija u Taiwanu, Nacionalni simfonijski orkestar i Orkestar Teatra Colon u Buenos Airesu, Filharmonijski orkestar Ciudad de Mexica, Nacionalni simfonijski orkestar i filharmonijski orkestar  OFUNAM u Mexicu, Simfonijski orkestar USC u Columbiji (Južna Carolina), Simfonijski orkestar Južnog Arkansasa, komorni orkestar St Martin in the Fields u Londonu, Ansambl za suvremenu glazbu u Moskvi, Simfonijski orkestar Hrvatske radiotelevizije u Zagrebu, Mariborski simfonijski orkestar, Nacionalni simfonijski orkestar u  La Habani, Njujorški komorni ansambl, Briselska filharmonija, Istanbulski simfonijski orkestar, Predsjednički orkestar Ankare, Izmirski simfonijski orkestar i brojni drugi orkestri.

Godine 1995. osniva festival pod nazivom “Prozori u 20. stoljeće” u talijanskom gradu Trevisu. Na ovom se festivalu promovira glazba i kultura današnjeg vremena, a među izvođačima se nalaze brojni talijanski i inozemni umjetnici. U 13-godišnjoj povijesti ovog festivala izvedeno je više od 150 koncerata, od kojih su mnogi bili svjetske ili talijanske premijere.

Stefano Mazzoleni debitirao je kao skladatelj u siječnju 2000. u pariškome Theatre du Roind-Point, kada je izvedena njegova  scenska glazba za predstavu “Matricule” Luca Bassonga.

Godine 1991. osniva glazbeni časopis  “Diastema”, jedan od najznačajnijih talijanskih časopisa specijaliziranih za muzikologiju i analizu. Ovo je ujedno jedini talijanski časopis uvršten u njemačku Opću enciklopediju glazbe. Predsjednik je izdavačke udruge “Ensemble 900”, specijalizirane za tekstove o glazbi, koja je do danas izdala oko 50 naslova.

Godine 2001. bio je član žirija na Međunarodnom natjecanju orkestralnih dirigenata Mario Gusella u Pescari, a 2002. godine na Međunarodnom opernom natjecanju Mario del Monaco koje se održava u talijanskom gradu Castelfranco Veneto.

U studenom prošle godine, imenovan je glavnim dirigentom i umjetničkim savjetnikom festivala Palermo Classica, koji će se održati u Palermu od 25. srpnja do 5. rujna 2015. godine.